產品原理

由電源（110V/220V/380V, 60/50 Hz) 驅動PhD高壓均質機的一個或者多個泵柱塞做往復運動，物料在柱塞作用下進入可調節壓力大小的閥組中經過特定寬度的限流縫隙均質區，瞬間失壓的物料以極高的流速（1000-1500米/秒）噴出,在均質閥內產生三種效應:空穴效應、撞擊效應、剪切效應。經過這三種效應相互作用處理過后，物料粒徑可均勻細化到100nm以下，細胞破碎率大于97％。

產品參數

產品參數

• 細胞破壁—高壓低溫破碎提取靶蛋白
  通過高壓細胞破碎儀使物料在柱塞作用下進入可調節壓力大小的閥組中經過特定寬度的限流縫隙均質區在均質閥內產生三種效應:空穴效應、撞擊效應、剪切效應的機械作用力從而打破細胞壁的束縛，把蛋白質從組織或細胞中釋放出來盡可能保持原來的天然狀態，不喪失活性，達到高效率破碎細胞的效果。采用高壓細胞破碎法，在細胞內產生的壓力效應，從而能夠有效地提取出蛋白質，且處理量大、破碎速度較快。這是一種機械處理細胞，物理抽提方法。
• 均質分散—高壓均質法
  物料在柱塞作用下進入可調節壓力大小的閥組中，在高壓條件下，溶液快速地通過均質腔，高速流動的流體突然經過特定寬度的限流縫隙均質區，液流速度激增，造成很大的速度梯度，同時壓力銳減，出現了很大的壓力梯度，產生了巨大的壓力差。使得瞬間失壓的物料以極高的流速（1000-1500米/秒）噴出，在均質閥內產生三種效應：空穴效應、撞擊效應、剪切效應。因此粒度或液滴同時受到強有力的剪切作用、高速撞擊作用；被柱塞壓縮的物料內積聚了極高的能量，造成高能釋放引起空穴爆破，使得液體物料分散系中分散相顆粒粒度或液滴微粒化，促進固液二相混合。
• 納米乳化—高能乳化法
  高能乳化法是利用極高的機械外力提供的能量去克服內外相液體之間的界面能，從而降低內相乳滴粒徑。高壓均質法是常最常用的納米技術。在脂肪乳的制備過程中，將已處理的粗乳經過高壓均質機的高壓泵導入，經過狹小的均質閥高速噴出，在剪切力、碰撞力等強力的作用下，對粗乳中的大乳滴進行破碎。高壓均質機通過粗乳在特定寬度的限流縫隙均質區，瞬間失壓，獲得高流速流體間產生局部湍流漩渦而產生的壓力差，將液體油脂充分打散成小液滴，有助于乳化劑對油脂或水分充分包裹形成較為細小的乳化顆粒，有助于產品的穩定性。高壓均質法是通過均質時間和次數來實現對粒徑大小及分布均勻度的控制，適用于具有一定流動性的乳劑體系。
• 脂質體整粒工藝
  在擠出樣品工藝這一方面，一是直接擠出，二是先均質后擠出。簡而言之就是可以通過擠出、機械設備分散等多種工藝，通過不同規格直徑、孔徑的納米級薄膜過濾,可制備出納米乳劑、脂質體等。直接擠出對于脂質體處方要求較高，少量時可采用氣動或者手動方式擠出，大量時采用高壓連續擠出。溶劑與溶質純度均較高，初步溶劑化制備的的脂質混懸液雜質與大顆粒含量較低時，可以直接通過過濾擠出初步處理的物料懸浮液。先均質后擠出對于脂質體處方要求相對而言較低，但此類樣品行均質處理成較小粒徑，然后再通過擠出器擠出，否則易出現膜堵現象。對于包含大顆粒或聚團較多的脂質混懸液，最好先用高壓均質機均質處理掉大顆粒或團聚較大的物料，初步處理的物料懸液再通過脂質體擠出器進行過濾擠出，這樣不容易堵塞聚碳酸酯膜，又可以獲得粒徑分布均勻且集中的終產物。
• 高速剪切工藝
  高速剪切機就是高效、快速、均勻地將一個相或多個相分布到另一個連續相中，而在通常情況下各個相是互不相溶的。由于轉子高速旋轉所產生的高圓周線速度和高頻機械效應帶來的強勁動能，使物料在定、轉子狹窄的間隙中受到強烈的機械及液力剪切、離心擠壓、液層摩擦、撞擊撕裂和湍流等綜合作用，從而使不相溶的固相、液相、氣相在相應成熟工藝和適量添加劑的共同作用下，瞬間均勻精細地分散乳化，經過高頻的循環往復，最終得到穩定的高品質產品。高速剪切機使物料通過高速旋轉的轉子與定子之間所產生的強力的剪斷、分散、沖擊、亂流等過程使其不斷產生新界面，將物料在剪切縫中迅速剪斷、壓縮、折疊，使其攪拌、混合，破碎成200nm～2μm的微粒。物料微粒化、乳化、混合、調勻、分散等在短時間內完成。

腫瘤壞死因子（TNF）

1975年，Carswell等發現并命名了TNF:先用細菌內毒素處理小鼠，而后在小鼠的血清中發現一種物質會導致腫瘤壞死，并將其稱為腫瘤壞死因子。1984年，Pennica等首先對人TNF-a的cDNA進行了成功克隆，并在大腸桿菌中得到了表達。1985年，Shalaby把腫瘤壞死因子分為TNF-α和TNF-β。腫瘤壞死因子( Tumor Necrosis Factor,TNF)是一種的具有抗腫瘤活性的細胞因子，具有抗腫瘤、抗病毒和免疫調節等多種生物活性。

大腸桿菌表達系統

原核表達系統是基因表達技術中發展最早，應用最廣泛的蛋白表達系統之一。近幾十年，大腸桿菌表達系統也不斷得到發展和完善，被科研及工業用戶大量用于各種重組蛋白表達。市面上的重組蛋白有30%是由大腸桿菌表達系統生產而來，是小分子細胞質蛋白或結構域表達的首選宿主。在大腸桿菌表達系統中表達的外源基因包括原核基因和真核基因；原核基因可以直接在大腸桿菌中表達出來，真核基因含有內含子，大腸桿菌不能對mRNA進行剪切形成成熟的mRNA，因此，真核基因一般以cDNA構建表達載體在大腸桿菌系統中表達。

應用方案

通過高壓細胞破碎儀使物料在柱塞作用下進入可調節壓力大小的閥組中經過特定寬度的限流縫隙均質區在均質閥內產生三種效應:空穴效應、撞擊效應、剪切效應的機械作用力從而打破細胞壁的束縛，把蛋白質從組織或細胞中釋放出來盡可能保持原來的天然狀態，不喪失活性，達到高效率破碎細胞的效果。即使用高壓勻漿破碎法采用高壓細胞破碎法，在細胞內產生的壓力效應，從而能夠有效地提取出蛋白質，且處理量大、破碎速度較快。這是一種機械處理細胞，物理抽提方法。

解決方案

首先富集菌體，收集胞內產物的細胞或菌體。然后進行細胞重懸，用適當的緩沖液或培養液將離心或沉降等方法得到的固體（沉淀、細胞、活性物質等等）重新懸浮。其次進行細胞破碎，使產物轉移到液相中。最后收集含生化物質的液相，進行碎片分離，分離除去細胞、菌體、細胞碎片、蛋白質的沉淀物和絮凝體等固體懸浮物，得到上清液或濾液。然后從澄清的濾液中提取胞內產物，從細胞裂解物中獲取目標產物。

1、發酵罐培養：根據rmh-TNF的表達，使用單因素法對由rmh-TNF在大腸桿菌中表達時的誘導時機、誘導維持時間、pH值、溶解氧等進行了研究，選擇出較好的發酵工藝參數。根據rmh-TNF代謝特點，通過對補料工藝的研究，確定了注射用重組改構人腫瘤壞死因子發酵罐發酵開始誘導后高溫滅菌的補料培養基以流加的方式對發酵罐進行補加的新補料工藝。

2、發酵液離心：用高速離心的方法收集菌體，將放罐接口與管式分離機進液口連接，開啟管式分離機冷凍水的供水閥門，開啟管式分離機(16000 rpm),控制發酵液流速1.0-1.5L/min離心，上清液經專用管道排至自動滅活罐滅活后排棄。離心完畢后取出菌體。

3、菌體洗滌：將菌體混懸于TES溶液中，緩緩攪拌洗滌，用高速冷凍離心機，在4℃下，8000 rpm,離心20分鐘。重復洗滌操作一次。濕菌體稱重，-20℃冰箱保存。

4、菌體破碎：將菌體混懸，調節高壓勻漿機泵馬達進氣閥門和出料管進氣閥門使流出管壓力在5000-20000 Psi范圍內對菌體進行勻漿破碎得到細胞破碎液。

PhD優勢

工程大腸桿菌HMS174菌種的全面檢定，確認該重組菌rmh-TNF工程菌構建正確，目的蛋白占菌體總蛋白的百分含量大于30%，菌種保持穩定，菌種穩定性好，呈短棒狀，無芽孢、支原體等微生物污染，革蘭染色及生化檢定呈典型的大腸桿菌特征，該菌適用于工程菌菌種庫。

◆破壁能力：高壓設計，輕松上壓；均質效率高，工藝穩定；穩定的破碎能力，更高的胞內物提取；純機械破碎，無化學污染；可放大工業化生產工藝設備

◆控溫效果：獨特溫控設計，內置和外置雙向控溫，確保均質過程及出料溫度可控。

◆活性保障：循環的控溫系統，蛋白活性不失活，細胞破碎后，活性保值高達99%                                                                 

◆無菌保障：金屬結構連接，沒有O型圈或墊片，無死角設計；在線排空結構設計；所有機型均可實現在線清洗（CIP）、循環清洗、拆裝清洗、在位滅菌（SIP）